Процедура Forever Young BBL омолаживает клетки на генном уровне

Исследования, проведенные в Стэнфордском университете, показали, что процедура Forever Young BBL может омолаживать клетки стареющей кожи на генном уровне, делая их функционально подобными клеткам молодой кожи.

Исследования, проводимые на моделях организмов, предполагают, что стареющие клетки могут быть функционально омоложены. Но применима ли эта концепция к коже человека? До сих пор этот вопрос оставался недоказанным. Предлагаем вам ознакомиться с результатами исследования, в ходе которого изучались генные изменения, происходящие вследствие фото и естественного старения (возрастного старения) кожи человека, а также влияние процедур широкополосного света (BBL) на эти процессы. Выяснилось, что старение кожи ассоциировано со значительными изменениями в РНК и что процедуры BBL позволяют их «омолаживать», то есть делать более сходными по экспрессии с генами клеток молодой кожи. Таким образом, процедура BBL может восстанавливать экспрессию генов в клетках с фото- и хронологическим старением кожи человека, подобно клеткам молодой кожи.

* РНК, рибонуклеиновые кислоты, являются молекулами-переносчиками информации с генома, представленного ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислотой). В исследованиях генома (ДНК) изучают молекулы РНК, как молекулы, являющиеся носителями информации определенных участков ДНК. Следовательно, упоминание РНК далее по тексту описывает процессы, происходящие в ДНК, т.е. в геноме клеток. (Примечание).

Anne Lynn S. Chang, отделение дерматологии Стэнфордского университета, медицинский факультет (Редвуд-Сити, Калифорния, США)

Patrick H. Bitter Jr, отделение эстетической дерматологии (Лос-Гатос, Калифорния, США)

KunQu, отделение дерматологии Стэнфордского университета, медицинский факультет (Редвуд-Сити, Калифорния, США)

Meihong Lin, отделение дерматологии Стэнфордского университета, медицинский факультет (Редвуд-Сити, Калифорния, США)

Nicole A. Rapicavoli, отделение дерматологии Стэнфордского университета, Медицинский институт Ховарда Хьюза (Стэнфорд, Калифорния, США)

Howard Y. Chang, отделение дерматологии Стэнфордского университета, Медицинский институт Ховарда Хьюза (Стэнфорд, Калифорния, США)

ВВЕДЕНИЕ

Старение является сложным процессом комплексных генетических изменений и воздействия окружающей среды и связано с множественными изменениями экспрессии генов. Но каким образом изменения на генном уровне сказываются на здоровье человека, до сих пор остается неизвестным. Многочисленные мутации единичных генов показывают продление жизни в моделях организмов (Partridge, 2010; de Magalhaes и соавт., 2012). Ограничения в диете также могут замедлять скорость старения, даже если начинают использоваться в конце жизни (Partridge, 2010). Совсем недавно в нескольких выступлениях было показано омоложение стареющих клеток или тканей, демонстрирующих удивительную обратимость процессов старения. Например, при гетерохронном парабиозе молодых и старых мышей высвобождаются циркуляторные факторы, которые восстанавливают функции стареющих стволовых клеток мышц (Liu and Rando, 2011). Кроме того, блокирование фактора транскрипции NF-kB в старых клетках эпидермиса мышей может прерывать клеточное старение и восстанавливать общую экспрессию генов клеток старой кожи, делая их подобными молодым клеткам (Adler et al., 2007).

Возникает вопрос: обладают ли такой же обратимостью процессы старения в коже человека, которые развиваются в течение десятилетий, а не месяцев или лет, как было показано на моделях мышей? Выявление применимых в жизни методов блокирования процессов старения является серьезным вызовом.

Фотоомоложение BBL (широкополосный свет), известный также как широкополосный импульсный свет (IPL), – общедоступная и популярная процедура «омоложения» кожи, является идеальной технологией для тестирования этой концепции. Согласно данным Американского общества эстетической и пластической хирургии (ASAPS), в 2009 году в США на эти процедуры было потрачено более 215 млн долларов. В отличие от абляционных процедур, улучшающих состояние кожи за счет термической деструкции и регенерации эпидермиса и поверхностного слоя дермы, BBL использует широкополосный некогерентный свет в диапазоне от 560 до 1 200 нм, который поглощается многими компонентами кожи. В настоящее время процедуры BBL используются для уменьшения выраженности морщин, при нарушении пигментации, при эритеме и эластозе (Bitter Jr, 2000; Negishi et al., 2001). Тем не менее молекулярные изменения, вызываемые этой процедурой, пока описаны не были.

Термин «омоложение» используется как исследователями, так и широкими слоями населения, и каждый вкладывает в него свое понятие. Именно поэтому требуется определиться с дефиницией. В данном исследовании мы трактуем понятие «омоложение» как восстановление показателей молодости в стареющих клетках и тканях. Действительно ли после процедуры BBL кожа омолаживается на молекулярном уровне и становится подобной молодой коже или же происходящие изменения связаны с раневыми процессами и регенерацией повреждений, что фундаментально отличается от молодой неповрежденной кожи?

Гистологические исследования подтверждают, что BBL достоверно снижает содержание меланина в дерме и устраняет телеангиэктазии (Bitter Jr, 2000; Prieto и соавт., 2002).

Также в нескольких исследованиях сообщалось об увеличении содержания коллагена в верхних слоях сосочковой дермы к третьей неделе после процедуры (Negishi et al., 2001). Однако синтез нового коллагена может носить изменчивый или краткосрочный эффект: данные ультраструктурного анализа кожи через 3 месяца после процедуры не показали признаков влияния на коллаген и эластин (Prieto et al., 2002).

Мы изучили молекулярные основы ответа на процедуры BBL, определяя общую экспрессию генов кожи человека с фото- и хронологическим старением после процедур BBL. Целью являлось отследить широкий спектр изменений в РНК стареющих клеток при воздействии BBL, включая изменения экспрессии генов (кодируемых и не кодируемых) и регуляцию генов.

ОПИСАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Участники исследования и материалы

Данное исследование проведено в соответствии с Хельсинской декларацией. После ознакомления и подписания информированного согласия пяти женщинам участницам в возрасте старше 50 лет провели процедуры BBL на левом предплечье. Критериями включения в исследование были тип кожи II или III по Фитцпатрику и умеренная или выраженная степень старения кожи на предплечье (McKenzie и соавт., 2010). Посещение соляриев, местное нанесение ретиноидов и проведение любых процедур на коже рук было запрещено за 1 месяц до начала и в течение всего исследования. Участники были проинструктированы защищать свои руки с помощью солнцезащитных кремов широкого спектра и одежды с длинными рукавами, а также избегать лишнего контакта с солнцем.

Процедуры проводились на платформе Joule компании Sciton с использованием модуля BBL. Участникам проводили 3 процедуры с интервалом 4 недели с использованием фильтров 515 или 560 нм одним импульсом длительностью 10–20 мс с удельной мощностью 8–14 Дж/см2. Во время одной процедуры выполнялись два или более прохода.

Через 4 недели после 3-й процедуры BBL проводилась Punch-биопсия участков кожи размером 4 мм на обработанной коже и на соседнем необработанном участке. Также проводилась Punch-биопсия (4 мм) с участков кожи, не подвергающихся воздействию солнечных лучей, у пяти участниц в возрасте до 30 лет, которые имели те же критерии включения в исследование, но не имели признаков фотостарения на руках.

Образцы были разделены пополам и помещены в раствор для стабилизации РНК или раствор формалина для окрашивания гемотоксилин-эозином.

Клинические и гистологические изменения

После трех процедур BBL на коже рук происходили улучшения клинических показателей хронологического старения и старения кожи под воздействием факторов внешней среды: мелкие морщинки (Р = 0,03), пигментация (Р = 0,02) и общие показатели старения кожи (Р = 0,01) (рис. 1 а–с). По данным гистологического исследования, признаки эластоза в образцах стареющей кожи с участков, подвергшихся процедуре BBL, были менее выражены в сравнении с образцами стареющей кожи, не подвергавшейся воздействию BBL (рис. 1 d–g). Окрашивание гистологических образцов методом PAS не показало изменений в количестве коллагена в дерме между обрабатываемыми и необрабатываемыми образцами кожи, хотя после процедуры BBL волокна коллагена были менее дезагрегированы (рис. 1 h–i). Образцы стареющей кожи после процедуры показывали субъективное увеличение плотности эпидермиса (рис. 1 e, g, i) в сравнении с образцами стареющей кожи, не подвергшейся воздействию (рис. 1 d, f, h).

Исследование изменения генов

Чтобы точно выявить признаки старения в окончаниях молекул РНК, мы вначале выявляли нарушения транскрипции участков генов, ассоциированных со старением, путем сравнения образцов молодой кожи с образцами нелеченой стареющей кожи, а затем тестировали, какое влияние оказывает процедура BBL на изменение этих показателей. Сравнение уровней транскрипции мРНК в молодой необработанной коже и стареющей необработанной коже, а также в стареющей необработанной и старею щей обработанной показало значительное увеличение уровней экспрессии в 3 530 генах (рис. 2 а).

Направленность изменения генов после процедуры BBL показана на рисунке 2 а: голубым цветом отмечено двукратное уменьшение, а желтым – двукратное увеличение экспрессии. Для наглядного визуального отображения значимых генов мы использовали визуальную тепловую карту. Справа от нее мы расположили таблицу, пурпурные полосы которой отображают основные биологические эффекты, за которые отвечают гены, в соответствии с генной онтологией. Например, «омоложенные гены» и lncRNAs (длинные не кодируемые РНК) расположены в обеих верхних и нижних частях визуальной тепловой карты. Гены, отвечающие за иммунный ответ и трансляцию, расположены в нижней половине карты. Гены, отвечающие за клеточную адгезию, расположены в верхней части карты. Активность этих генов снижена в группе молодых волонтеров и увеличена в группе нелеченых волонтеров со стареющей кожей, а в группе леченных волонтеров со стареющей кожей активность генов адгезии находится на среднем уровне. Соседняя таблица с пурпурными столбцами указывает на то, в каких генах происходят изменения и за какие биологические процесс отвечают эти гены. Визуальная тепловая таблица при помощи «теплых» (желтый – повышение) и «холодных» (синий – снижение) цветов указывает направленность изменения активности генов – увеличение или снижение их функции, что позволяет сравнивать молодую кожу, стареющую нелеченую и стареющую леченную кожу. Например, молодая кожа и леченная старая кожа показывают увеличение уровней транскрипции, отвечающих за «иммунный ответ» и «трансляцию», поскольку обе эти группы показали увеличение активности генов (желтый цвет). И наоборот: в группе нелеченых пациентов со стареющей кожей происходит снижение активности генов (синий) «иммунного ответа» и «трансляции» в сравнении с двумя другими группами.

Генные изменения, связанные со старением, многогранны и объединяют в себе изменения нескольких биологических функций. Первая пятерка наиболее выраженных изменений с повышением активности генов стареющей нелеченой кожи в сравнении с молодой нелеченой кожей включает:

• трансляцию (Р = 4,7 х 10-12);
• трансляционное удлинение (Р = 5,1 х 10-7);
• макромолекулярные сложные комплексы (Р = 7,5 х 10-6);
• нкРНК (некодируемые РНК), отвечающие за метаболизм (Р = 6,2 х 10-6);
• РНК-процессинг (Р=2,5х10-6).

Первая пятерка генов со снижением функции в группе стареющей нелеченой кожи в сравнении с молодой кожей включала:

• гены, отвечающие за клеточную адгезию (Р = 1,5 х 10-17);
• биологическую адгезию (Р = 1,5 х 10-17);
• гомофильную клеточную адгезию (Р = 7,8 х 10-8);
• ген, отвечающий за развитие скелета (Р =3,2 х 10-7);
• энзим-связанный белок-рецептор сигнального пути (Р = 5,2 х 10-6).

Изменения в этих генах напоминают изменения набора генов при старении в других тканях и организмах. BBL способствует изменению экспрессии генов Гены, уровень экспрессии которых в стареющей коже, леченной BBL, был ближе к генам молодой нелеченой кожи, были обозначены RGs («омоложенные гены»).
Иерархическая кластеризация показала, что экспрессия генов леченной стареющей кожи более сходна с нелеченой молодой кожей, чем с нелеченой стареющей кожей (рис. 2 а). Омоложенные гены отвечают за сцепленные с ними определенные биологические функции, шесть наиболее выраженных из них – это:
• трансляция (P = 5,8 х 10-11);
• РНК-процессинг (Р = 6,3 х 10-8);
• нкРНК-процессинг метаболизма (Р = 1,4 х 10-7);
• регуляция клеточного метаболизма белка (Р = 1,6 х 10-5);
• макромолекулярные катаболические процессы (Р = 2,1 х 10-5);
• клеточный цикл (Р = 2,4 х 10-5) (рис. 2 b, справа вверху).
Более детальное исследование показало экспрессию «омоложенных» процедурой BBL генов, связанных с ключевыми регуляторами, известными как гены, контролирующие старение (рис. 2 с).
Они включают:
• ZMPSTE24 – металлопротеиназу, которая перерабатывает ламин А. Дефект этого гена вызывает синдром выраженного реждевременного старения, прогерию Хатчинсона – Гилфорда;
• рецептор IGF1R – этот ген непосредственно связан со старением и долгожительством в моделях человека, мышей и других организмов (Liang et al., 2011; Tazearslan et al., 2011);
• другие «омоложенные гены» – EIF4G1 и EIF4EBP1 – отвечают за повышение продолжительности жизни у Caenorhabditis elegans (свободноживущая нематода, которая широко используется как модельный организм) (Curran и Ruvkun, 2007);
• MLL – регулятор транскрипции, связанный с теломерами (Caslini et al., 2009), и метилат H3K4, который отвечает за нормальную продолжительность жизни у C. ele gans (Greer и соавт., 2010);
• MAP3K5 (ASK10) – регулирует активность киназ в ответ на оксидативный стресс в модели стареющих мышей Klotho (Hsieh и соавт., 2010);
• PSMD8 – является компонентом протеасом, нарушение работы которых способствует старению кожи человека (Hwang и соавт., 2007);
• RING1 и MOV10 – участвуют в процессах, контролирующих длительность жизни фибробластов человека (Itahana и соавт., 2003);
• EEF2 (эукариотический фактор трансляции элонгации 2) – был также отнесен к «омоложенным генам». Согласно исследованиям, он связан со снижением синтеза белка у крыс (Parado и соавт., 1999);
• наконец, ряд генов-супрессоров, которые контролируют клеточный цикл и обеспечивают целостность генома, таких как ING4, супрессор опухоли, DAXX и MSH2, были также «омоложены».
Влияние процедуры BBL на иммунный ответ отражается в изменении показателей иммунного ответа по сравнению с образцами нелеченой молодой кожи. Рисунок 2 а показывает, что, хотя гены, отвечающие за иммунный ответ, «повышают» активность после процедуры, этот профиль «повышения» больше напоминает молодую нелеченную кожу. Это предполагает, что небольшая часть иммунного ответа, которая «повысилась» после процедуры, является частью «омоложения» и является неспецифическим ответом на процедуру Forever Young BBL.
Таким образом, процедура Forever Young BBL способна восстанавливать множество молекулярных свойств молодой кожи в стареющих клетках кожи человека, по меньшей мере в краткосрочной перспективе. К тому же мы не обнаружили изменений экспрессии генов, связанных с раневыми процессами и процессами рубцеобразования.

Специфический ответ на процедуру Forever Young BBL

Мы также рассмотрели возможность того, что процедура BBL может оказывать специфическое лечебное действие, не связанное со старением. Например, процедура Forever Young BBL могла бы стимулировать процессы заживления ран или рубцеобразования в дополнение к омолаживающему действию.
Мы выявили существенные изменения экспрессии 1 112 генов, которые наблюдались только в образцах, прошедших процедуру омоложениея Forever Young BBL, но этих изменений не было выявлено в образцах нелеченой молодой и нелеченой стареющей кожи. Среди этих генов со специфическим ответом на процедуру были выделены пять наиболее выраженных биологических эффектов с увеличением экспрессии генов после процедуры:

• иммунный ответ (Р = 3,8 х 10-12);
• положительная регуляция иммунной системы (Р = 2,0 х 10-8);
• активация клеток (Р = 5,7 х 10-8);
• активация Т-клеток (Р = 6,0 х 10-7);
• защитные реакции (Р = 1,4 х 10-7).

Эти реакции связаны с иммунным ответом на омоложение Forever Young BBL и отличаются от иммунного ответа генов, которые также увеличивались у не леченных молодых. Пятью наиболее значимыми биологическими эффектами, связанными со снижением экспрессии генов после процедуры, были:

• регуляция транскрипции (Р = 2,0 х 10-6);
• транскрипция (Р = 1,7 х 10-5);
• ответ на органические вещества (Р = 1,1 х 10-4);
• ответ на гормональные стимулы (Р = 4,4 х 10-4);
• отрицательная регуляция транскрипции (Р=4,7 х 10-4).

Эти гены отличаются от предварительно описанных эффектов на «заживление», которые характеризуют процессы заживления кожи (Chang и соавт., 2005), однако сложно сделать прямое сравнение, поскольку нет описанных в литературе данных, эквивалентных нашим, по активности генов, связанных с раневыми процессами на 4-ю неделю.
И наконец, топ-10 генов, повышающих и снижающих активность у леченных BBL со стареющей кожей в сравнении с нелеченой стареющей кожей, приведен в таблице 1.

Дискуссия

Фото до и после Forever Young BBL

Где сделать Forever Young BBL в Киеве?